在疫苗生產(chǎn)、生物制藥，細(xì)胞免疫，Car-T，以及基礎(chǔ)科研過(guò)程中的細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)，支原體污染的預(yù)防和祛除，是保證生產(chǎn)質(zhì)量和實(shí)驗(yàn)順利的重要環(huán)節(jié)。

往期文章，已經(jīng)為大家介紹了『支原體檢測(cè)』的常規(guī)方法，其中包括熒光定量PCR方法的檢測(cè)試劑盒，以及可做方法學(xué)驗(yàn)證的標(biāo)準(zhǔn)品等。

本期文章，我們將進(jìn)一步、多角度的介紹『支原體祛除和預(yù)防』的常見(jiàn)簡(jiǎn)便方法，希望對(duì)疫苗生產(chǎn)、生物制藥、細(xì)胞學(xué)研究等項(xiàng)目的質(zhì)檢質(zhì)控有所幫助。

關(guān)于整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中支原體祛除與預(yù)防，我們將從以下三個(gè)方面展開(kāi)：

一、工作區(qū)域中支原體祛除與預(yù)防

支原體可以說(shuō)是“無(wú)處不在"，稍有不慎，環(huán)境中那些對(duì)細(xì)胞有害的支原體，很容易污染培養(yǎng)體系。

因此，應(yīng)將支原體的清除與預(yù)防，日常實(shí)驗(yàn)室工作區(qū)域的清潔、維護(hù)過(guò)程中。

除了正確穿戴實(shí)驗(yàn)防護(hù)用具外（如：口罩、細(xì)胞培養(yǎng)室專用實(shí)驗(yàn)服、鞋套等），還應(yīng)定期*清潔工作區(qū)域：用新捷爾滅等稀釋液進(jìn)行墻面、地面的噴灑和擦拭。對(duì)于桌面、實(shí)驗(yàn)臺(tái)面以及擺放了儀器設(shè)備的地方，應(yīng)選用針對(duì)性更強(qiáng)的支原體祛除預(yù)防試劑。

Minerva Biolabs Mycoplasma-off™就是一個(gè)不錯(cuò)的選擇。該噴霧劑/濕巾中含有支原體專用殺除劑Mynox®，可在幾分鐘內(nèi)迅速殺除支原體，而且對(duì)葡萄球菌、腸球菌、大腸桿菌、奇異變形桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、牛腹瀉病毒、腺病毒、多瘤病毒、鼠諾如病毒、牛痘病毒、真菌孢子等微生物也有比較好的清除效果。

Mycoplasma-off™安全性高，沒(méi)有腐蝕性和致癌性成分，相比起其他消毒成分，將人體和實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備的消毒風(fēng)險(xiǎn)降至更低。

即用型消毒液，可以快速簡(jiǎn)單地保持工作區(qū)的清潔干凈。

二、細(xì)胞培養(yǎng)體系中支原體祛除與預(yù)防

在進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)時(shí)，如果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢、甚至大量漂浮、細(xì)胞培養(yǎng)液提前變黃等情況，請(qǐng)務(wù)必警惕，有可能就是中了支原體的招。

對(duì)于珍貴的細(xì)胞株，我們往往希望可以拯救一下，首先可以用PCR/qPCR方法檢測(cè)細(xì)胞是否被支原體污染。

如細(xì)胞株已發(fā)生污染，采取以下三種方法處理，能在盡可能短的時(shí)間，高效祛除支原體，并有一定的預(yù)防能力：

1、Zell Shield®支原體祛除劑（培養(yǎng)基用）

適用范圍

• 細(xì)胞已發(fā)生支原體污染，但又不愿丟棄，希望繼續(xù)培養(yǎng)（如已轉(zhuǎn)染或大量擴(kuò)增的細(xì)胞）。

• 初始培養(yǎng)的原代細(xì)胞。

• 存在支原體污染高風(fēng)險(xiǎn)的細(xì)胞。

用法

• 1:100加入培養(yǎng)基。

• 當(dāng)細(xì)胞存在支原體污染時(shí)，應(yīng)先對(duì)細(xì)胞懸浮沖洗三次，再用含Zell Shield®培養(yǎng)基培養(yǎng)。每次傳代前都應(yīng)做懸浮沖洗處理。連續(xù)傳代4次，支原體即可祛除。

2、Mynox® Gold支原體祛除劑（珍貴細(xì)胞保種用）

適用范圍

被支原體污染的珍貴細(xì)胞或不易獲得的生物樣本（如細(xì)胞種子）。

用法

• 將「首CI治療液」加入到4.5ml培養(yǎng)基（FBS需≤5%）中，培養(yǎng)細(xì)胞（細(xì)胞數(shù)為104~105）。

• 細(xì)胞長(zhǎng)至80%-90%匯合時(shí)，細(xì)胞傳代。將1管「鞏固防護(hù)液」加到9.5ml培養(yǎng)基中，用該培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

• 重復(fù)步驟2，細(xì)胞再傳代2次，支原體即*祛除。

注意：每次傳代時(shí)，最好都能把細(xì)胞懸浮沖洗三次，可取得更好的治療效果。

3、Mynox®支原體祛除劑（珍貴樣本用）

適用范圍

被支原體污染的珍貴細(xì)胞、不易獲得的生物樣本或病毒收獲液（特別是不能長(zhǎng)期培養(yǎng)的樣品）。

用法

對(duì)于貼壁細(xì)胞：

• 培養(yǎng)皿中加入200μl Mynox®和 2.8ml培養(yǎng)基中（FBS≤5%），混勻。

• 再加入2ml細(xì)胞（細(xì)胞數(shù)為10^4~10^5，培養(yǎng)基中的FBS需≤5%）。

• 細(xì)胞培養(yǎng)2小時(shí)，棄上清，換用新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)4代即可。

對(duì)于懸浮細(xì)胞：

• 在離心管中加入200μl Mynox®和1.6ml胰酶（0.125 %，5 mM EDTA in PBS），混勻。

• 加入1.6ml細(xì)胞（細(xì)胞數(shù)為10^4~10^5）。

• 室溫靜置30min。

• 低速離心5min。棄上清，換用新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)4代即可。

三、水浴鍋、水箱等支原體祛除與預(yù)防

水浴鍋、細(xì)胞培養(yǎng)箱中的水槽，也容易變?yōu)楦黝愇廴咀躺臏卮病１３炙鄣臐崈?，?duì)細(xì)胞培養(yǎng)的順利進(jìn)行非常重要。因此在進(jìn)行清潔時(shí)，不要忘記水浴鍋、水槽等地方。

這里推薦大家使用支原體祛除劑（水槽用）——Water Shield™。

Water Shield™可持續(xù)作用4周，使水源避免受到支原體、細(xì)菌、真菌、霉菌、孢子的污染。且不含醛類或疊氮化物，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害。

使用起來(lái)也十分便捷，Water Shield™與無(wú)菌水按1:200比例，直接加入水中，使用方便，使用后不產(chǎn)生水垢